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科普丨曝光吧:藏在袜子里的微生物君们

来源:广州工业微生物检测中心 点击:654 时间:2018-05-07

    微生物在自然界中无处不在,与人类生活密不可分。日常生活中,纺织品是这些微生物的良好寄生地。

    人的脚心每平方厘米有620个左右汗腺,当人体出汗时,脚上的鞋袜让汗液不易挥发,泡在汗液中的双脚因为不透气滋生大量细菌,这些细菌在脚部繁衍、活跃,散发出恶臭。袜子作为人们生活的必需品,产品虽小,但它的性能好坏却直接影响到脚部的舒适和人体的健康。

    普通人平均每天12小时穿着袜子,可以说是“人体的第二皮肤”,如果袜子具有抑菌功能,无疑给人体健康树立了一道屏障。袜子的保健、护肤作用越来越受到重视,抗菌防臭、吸湿排汗等具有保健功能的袜子不断推陈出新。

    那么,抗菌袜真的有宣称的抗菌防臭作用吗?所抑制的微生物又是哪些?我们设计了如下的实验来验证。

抗菌袜抗菌性能测试

1.试验准备

1.1测试样品的准备:按照标准FZ/T73023将洗涤50次的抗菌袜作为待测样品,取标准空白布作为空白试样,分别剪成0.5cm*0.5cm大小的碎片。称取0.75g多份,121℃灭菌15min,备用。

1.2接种菌液的准备:金黄色葡萄球菌和大肠杆菌接种液的准备:取3-10代细菌菌种,在营养琼脂培养基上划线,37℃培养24h后挑取典型菌落,接种至营养肉汤中,37℃振荡培养18-20h,制成接种菌悬液。白色念珠菌接种液的制备:从3-10代细菌种中取一接种环,划线至沙氏琼脂培养基斜面上,培养成熟后用PBS缓冲液洗下菌苔,均匀稀释备用。

2.试验操作 

    准备3个250ml三角锥瓶,一个加入样品,一个加入空白布样,一个不加式样用于阳性对照,在每个烧瓶中加入70ml0.03mol/L PBS缓冲液,再各加入5ml已准备好的接种菌液。做“0”接触时间取样,将空白试样和测试样品振荡培养后取样,对其进行稀释涂布计数。

3.结果报告

    通过对比空白试样和抗菌试样18h后的活菌数并计算抑菌率发现:在洗涤50次后,抗菌袜对三种测试微生物的抗菌率均达到95%以上,其中,大肠杆菌为99.02%,金黄色葡萄球菌为97.66%,白色念珠菌为96.35%。根据标准FZ/T73023规定,该抗菌袜符合AAA级标准。

人体脚部穿袜后

微生物菌落总数测试

1. 取样

    本试验选取广州市的3名男士和3名女士作为志愿者,让其一只脚穿着从超市购买的未经抗菌处理的普通袜,另一只脚穿着抗菌袜。为防止在染整加工过程中可能附着的化学品对本实验的影响,如浮离的染料等也可能具有一定的抗菌作用,所有的袜子均用无抗抑菌的洗衣粉在洗衣机内洗涤一次,干燥后备用。志愿者在穿着12h、3天(每天正常洗脚,不更换袜子)后将测试袜交回,并描述是否汗脚、是否有臭味等情况。

2. 微生物总数测定

    在无菌条件下,剪取每双测试袜的袜底部位,放入含有400ml0.03mol/l PBS缓冲液的三角锥形瓶中,用玻璃棒搅拌均匀后,将样液用0.03mol/lPBS做10倍系列稀释,选取适宜稀释度,取100ul涂布于平皿上,置于生化培养箱中,细菌37℃培养24h后计数,真菌28℃培养48h后计数。

3.测试结果

    经过测试,在穿着12h后,抗菌袜上面的细菌总量范围在<400cfu/双~2.00×104cfu/双,真菌总量范围在<400cfu/双~4.00×102cfu/双。普通袜上面的细菌总量范围在2.73×106cfu/双~6.40×107cfu/双,真菌总量范围在1.2×103cfu/双~9.24×105cfu/双。

    从测试结果看,真菌的总量远低于细菌,这是因为真菌生长速度较细菌慢。另外,男士普通袜上的细菌平均总量稍高于女士的总量,而抗菌袜上的数据区别不显著。袜子穿着3天后,不管是普通袜还是抗菌袜,其细菌总量和真菌总量都有较大的增长,特别是普通袜的真菌数量,增长可达1万倍,与细菌菌落总数相当。

    抗菌袜的数量虽有增加,但总体比普通袜穿着一天的菌量要少。且在臭味感官评价中,志愿者们穿着普通袜12h和3天,均能闻到难闻的臭味;而抗菌袜在同样的穿着时间里,均没有闻到异味。

△ 图1 普通袜和抗菌袜穿着12h、3天的细菌、真菌培养图片

注:PX1a, PX1b为普通袜穿着12h后细菌培养图片;KX1a,KX1b为抗菌袜穿着12h后细菌培养片;PZ1a, PZ1b为普通袜穿着12h后真菌培养图片;KZ1aKZ1b为抗菌袜穿着12h后真菌培养图片;PX3a, PX3b为普通袜穿着三天后细菌培养图片;KX3aKX3b为抗菌袜穿着三天后细菌培养图片;PZ3a,PZ3b为普通袜穿着三天后真菌培养图片;KZ3aKZ3b为抗菌袜穿着三天后真菌培养图片。

细菌高通量测序与鉴定

    在第三部分微生物菌类总数测试试验中,我们采用的是传统的平皿纯培养方法,但是人们发现,这种纯培养的方式仅能培养出1%的易培养微生物,如葡萄球菌,而99%以上微生物因为培养环境不适及优势菌的抑制作用而无法培养出,限制了人们对于微生物菌群结构全面和深入的了解。

    近年来,随着宏基因组学(metagenomics,指通过直接提取特定环境中全部微生物总DNA,对微生物群的基因总和进行功能基因筛选和测序分析的一种新的应用学科)的兴起,人们可以对环境中所有的微生物进行检测,而不是针对单个微生物进行培养和分离,因此能够对包括无法培养出的所有微生物进行全面的分析,以揭示更高更复杂层次上的生命规律。

    在本研究中,我们想了解普通袜上的微生物菌群,即了解抗菌袜抑制的微生物,而采用了宏基因组提取与高通量测序的方法。

1. 试验过程

     由于日常生活中大多数人穿着袜子的时间约为12h,而用于高通量测序的菌落总数需在106以上,所以选取穿着普通袜的第4号志愿者(细菌菌落总数为6.40×107)的细菌微生物菌群进行测序与分析鉴定。

1.1基因组DNA的提取和PCR的扩增:将试验3.2中的样液用0.45um的滤膜过滤,备用。采用PowerfecalDNA Isolation Kit(MoBio, 美国)试剂盒,提取滤膜上的微生物的总DNA。提取的总DNA采用NewEngland Biolabs 公司的Phusion®High-Fidelity PCRMaster Mix with GC Buffer进行扩增。

1.2文库构建和上机测序:使用TruSeq®DNAPCR-Free Sample Preparation Kit 建库试剂盒进行文库构建,构建好的文库经过Qubit和Q-PCR定量,合格后使用HiSeq2500PE250进行上机测序。

1.3生物信息学分析:将测序数据上传至MR-RAST服务器端。去除低质量的序列后进行数据分析,计算在97%的相似水平上每个样本的操作分类单元数量,进行OTUs(OperationalTaxonomic Units)聚类和物种分类分析。

2.袜子上细菌总DNA测序结果分析

    通过提取普通袜中微生物基因组DNA,对16SrRNA V4区测序,共获得用于物种分类的OUT6352 条,涵盖了11门、26纲、55目、103科、213属的细菌。

△ 图2 用Krona对注释结果进行绘图展示

2.1 门、纲、目水平的优势菌群分布特征

    菌群分类发现,放线菌门(Actinobacteria29.1%)、变形菌门(Proteobacteria37.6%)、厚壁菌门(Firmicutes25.5%)和拟杆菌门(Bacteroidetes7.2%)是主要的细菌菌门,其相对丰度占群落的99.4%。

△ 图3 样品中门水平细菌菌落结构及分布

    在纲水平上,放线菌门的放线菌纲(Actinobacteria 100%)、变形菌门的α-变形菌纲(Alphaproteobacteria14.6%)、γ-变形菌纲(Gammaproteobacteria84.8%)、厚壁菌门的芽孢杆菌纲(Bacilli 99.6%)、拟杆菌门的黄杆菌纲(Flavobacteriia97.2%)和 鞘脂杆菌纲(Sphingobacteriia 1.4%)是主要的优势菌群。其中,放线菌纲的优势菌目为棒杆菌目(_Corynebacteriales 68.0%)  和微球菌目(Micrococcales 30.9%),α-变形菌纲的优势菌目为柄杆菌目(Caulobacterales 34.5%)、红杆菌目(Rhodobacterales 29.1%)、红螺菌目(Rhodospirillales 29.1%), γ-变形菌纲的优势菌目为假单胞菌目(_Pseudomonadales96.6%),芽孢杆菌纲的优势菌目为芽孢杆菌目(Bacillales 98.4%),黄杆菌纲的优势菌目为黄杆菌目(Flavobacteriales 100%)。

△ 图4 样品中纲水平细菌菌落结构及分布
△ 图5 样品中目水平细菌菌落结构及分布

2.2属水平的优势菌群分布特征

    以属为分类单元分析样品的细菌群落结果如图6所示。普通袜上的细菌覆盖了213个属,其中相对丰度大于1%的包括11个属,分别是葡萄球菌属 ( Staphylococcus,24.9%)、棒状杆菌属( Corynebacterium,19.5%)、水栖菌属(Enhydrobacter,18.4%)、不动杆菌属(Acinetobacter,8.8%)、金黄杆菌属( Chryseobacterium ,6.7%)、微球菌属(Micrococcus, 6.2%)、假单胞菌属( Pseudomonas,3.3%)、玫瑰单胞菌属(Roseomonas, 1.6%),泛生菌属(Pantoea 1.0%)及未知属2个(3.1%)。

△ 图6 样品中属水平细菌菌落结构及分布

2.3属水平优势菌群分析

    葡萄球菌属(Staphylococcus,24.9%):是一群革兰氏阳性球菌,因常堆聚成葡萄串状,故名。多数为非致病菌,少数可导致疾病。葡萄球菌是最常见的化脓性球菌,是医院交叉感染的重要来源。

    棒状杆菌属( Corynebacterium,19.5%):革兰氏染色阳性杆菌。因其成员的一端或两端膨大呈棒状而得名。治病物质主要是外毒素。病菌通常在咽喉部粘膜上生长繁殖并分泌外毒素,可引起局部炎症,形成灰白色假膜。外毒素入血后引起全身中毒症状,常损害心肌与外周神经等。

    水栖菌属(Enhydrobacter18.4%:极短的直杆菌,外观似球状,含有气泡。单个、成对或出现短链。革兰氏阴性。从葡萄糖和其他碳水化合物代谢产酸。

    不动杆菌属(Acinetobacter8.8%生物学特性 革兰阴性球杆菌,常见成对排列,可单个存在,有时形成丝状和链状。不动杆菌属(Acinetobacter)非发酵菌是条件致病菌,当机体抵抗力降低时易引起机体感染,是引起医院内感染的重要机会致病菌之一。

    金黄杆菌属( Chryseobacterium6.7%该细菌为革兰氏染色阴性,菌落典型半透明、光滑、全缘或偶尔不透明。菌落在固体培养基上生长物有黄色、橙色、红色或褐色色素,其色泽随培养基和温度而变化。该菌严格好氧,培养温度应低于30℃,否则可抑制生长。黄杆菌可引起肺炎,也可招致脑膜炎、败血症等感染。该病的致病力不强,为条件致病菌,一般情况下不引起感染,但在机体免疫力下降时可能引起感染。

    微球菌属(Micrococcus 6.2%该菌广泛存在于自然界。化能异养菌,代谢为严格的呼吸型。通常可利用的碳水化合物有丙酸盐、乙酸盐乳酸盐、琥珀酸盐谷氨酸盐和碳水化合物。产气,产少量酸或不产酸。

    假单胞菌属( Pseudomonas3.3%专性需氧的革兰氏染色阴性无芽胞、有荚膜杆菌,呈杆状或略弯。存在于土壤、淡水、海水中。目前已确认有 29种,其中至少有3种对动物或人类致病。

    玫瑰单胞菌属(Roseomonas 1.6%:是一种粉红色的、革兰氏阴性、需氧的小球杆菌。1993年才对该菌进行分类和正式命名,在《伯杰氏细菌鉴定手册》第9版上还没有收录。该菌多是从一些临床病人标本中分离获得,如血、伤口、渗出液、溃疡等,80%的分离病人多合并一些免疫低下疾病,因此许多学者普遍认为,该菌可能为条件致病菌,临床上确有因合并该菌感染而致死的病例报道。我国目前还没有关于这方面临床病例的报道。近来,一些学者又从饮用水、淡湖水、土壤以及其他一些自然环境样本中分离到了玫瑰单胞菌。本文是第一次从人体皮肤中报道分离出此菌,且为脚部的优势菌群,占比1.6%

    泛生菌属(Pantoea 1.0%细胞呈直杆状,以周生鞭毛运动,大多数菌株产生黄色素。兼性厌氧,具有代谢和发酵类型的化能异养菌。最适温度30℃。 D-葡萄糖和其他糖类可产酸,不产气。分离自植物表面、种子、土壤和水,也可从动物和人的伤口、血和尿中分离到。是人的条件致病菌。

    其他(3.1%):在本研究中,有两种优势菌群不能划到确定的属,分别隶属于变形菌门α-变形菌柄杆菌目,柄杆菌科和变形菌门 α-变形菌红杆菌目, 红杆菌科。其中可能包含对人畜有致病性的潜在病原菌。

总结

    在本研究中,为了证明抗菌袜的抗菌性能,我们选取了检测结果符合AAA级标准的抗菌袜。让3名男性、3名女性志愿者穿着抗菌袜和普通袜,分别测试其1天、3天的细菌、真菌总数。数据表明,穿着抗菌袜的志愿者的细菌、真菌总数远低于普通袜,且穿着3天也没有臭味。

    脚臭的根源是脚部皮肤排汗较多引起细菌、真菌滋生,部分细菌繁殖会产生氨气等有味气体,再加上汗液中的尿素、乳酸,这样就会发出一种臭味。抗菌袜能有效抑制微生物的繁殖,有效解决异味的产生。

    为了验证抗菌袜所抑制的菌群,我们选取了普通袜穿着1天的样本,提取其中的微生物总DNAPCR扩增、构建文库并进行高通量测序与分析。我们共获得用于物种分类的OUT6352 条,涵盖了11门、26纲、55目、103科、213属的细菌。在我们穿着普通袜1天时,放线菌门(Actinobacteria)、变形菌门(Proteobacteria)、厚壁菌门(Firmicutes)和拟杆菌门(Bacteroidetes)是主要的细菌菌门。在213属细菌中,有11种为优势菌群,值得我们注意的是,在这11种优势菌群中,有不少是致病菌,这些致病菌在人体上,特别是脚部出现糜烂、水疱等疾病时,无疑是一群隐形的健康杀手!

关注脚部卫生,勤洗脚,勤换鞋袜,抗菌袜也是一个不错的选择!

 

 

文章名:《曝光吧:藏在袜子里的微生物君们》

作者:广州工业微生物检测中心 轻工产品检测事业部 胡海艳博士

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